La  venne istituita ufficialmente con il Reale Decreto del 7 marzo 1912, da quel momento divenne una realtà autonoma rispetto all’Istituto di belle arti, nella quale il conservatore assumerà le consegne del Palazzo ducale e delle opere d’arte ivi contenute esercitando quindi il compito della tutela.

La problematica principale della Galleria ai suoi albori, era l’esiguità delle collezioni per le spoliazioni e diaspore avvenute in una prima fase dopo la morte nel 1482 di Federico di Montelfetro, e dopo la morte nel 1631 dell’ultimo erede maschio dei Della Rovere, quando l’intero patrimonio (Ducato, terre e palazzi) fu devoluto allo Stato della Chiesa. In assenza di una propria collezione, si esposero inizialmente in Galleria le opere provenienti dalle sedi degli istituti soppressi, in attuazione alle disposizioni del decreto L. Valerio del 1861. La storia della Galleria oltre che alle collezioni è strettamente legata al restauro del Palazzo, ogni allestimento ha coinciso con il recupero di spazi prima inaccessibili. Con l’inaugurazione ufficiale avvenuta nel maggio 1913, sia ha quindi la prima sistemazione delle collezioni sotto la direzione di Lionello Venturi; durante questo periodo la Galleria si arricchisce degli affreschi staccati attribuiti a Antonio da Ferrara proveniente dalla cappella Paltroni, del gonfalone raffigurante il beato Giacomo della Marca, attribuito dal Venturi a Carlo Crivelli (ora dati al fratello Vittore) e di due acquisti del Ministero della Pubblica Istruzione: una Madonna con Bambino di Giovanni Santi e un San Francesco di Federico Barocci.
Un notevole incremento delle collezioni si avrà con la direzione di Luigi Serra dal 1915 al 1933, ottenuto soprattutto per mezzo di depositi di opere d’arte, come la “Flagellazione” e la Madonna di Senigallia di Piero della Francesca, i dipinti di Giovanni Santi e Timoteo Viti, lo Stendardo di Signorelli ecc.. L’ordinamento del Serra è stato molto importante nella storia della Galleria perché oltre alle sezioni dedicate alla sequenza cronologica della collezione dei dipinti e al museo medioevale e moderno, era presente un settore con le fotografie delle opere già conservate nel palazzo. Nel 1927 lo Stato riconobbe l’importanza della Galleria marchigiana inviando ad Urbino un’opera di Raffaello, il Ritratto di Gentildonna “la Muta. Sotto la Direzione del Pacchioni tornarono ad Urbino dalla Galleria Barberini di Roma 14 tele raffiguranti gli Uomini Illustri, originariamente collocate nello Studiolo del Duca., le altre 14 sono invece a Parigi, attualmente esposte al Museo del Louvre. E’ significativo ci sia stato un nuovo impulso all’attività di tutela e valorizzazione del Palazzo e della Galleria dal 1939, anno nel quale venne istituita la Soprintendenza alle Gallerie (poi, ai beni storico artistici), la quale oltre ai compiti di tutela del patrimonio artistico marchigiano del territorio, ha svolto un’attività culturale determinante sull’assetto museografico della Galleria.
Fu Pasquale Rotondi nel 1939 ad essere nominato nel ruolo di Soprintendente alle Gallerie e alle Opere d’Arte delle Marche, a lui si deve il primo studio storico sul Palazzo Ducale condotto anche tramite rilevi, che sono stati fondamentali insieme alla ricerca storica per conoscerne i segreti dello spazio, architettonico e pittorico, è significativo che si arrivò in questo periodo alla scoperta del ciclo pittorico di Giovanni Boccati nell’appartamento della Jole, all’analisi degli arredi fissi dei camini comprendendone gli spostamenti negli ambienti nel Palazzo.
Seguirono poi altre importanti direzioni quella di Pietro Zampetti, Giuseppe Marchini, Pietro Torriti, Italo Faldi (1973-75) durante la quale è sono avvenuti il furto è ritrovamento dei capolavori la Flagellazione, la Muta e la Madonna di Senigallia recuperate al tempo della Direzione di Dante Bernini (1975-1978). E poi ancora Paolo dal Poggetto dal 1979 al 2004, Lorenza Mochi Onori, Aldo Cicinelli, Vittoria Garibaldi, Maria Rosaria Valazzi.
Con il D.M. 27 novembre 2014 del Ministero dei beni e delle attività culturali e del turismo la Galleria Nazionale delle Marche, prima dipendente dalla soppressa Soprintendenza Beni Storici Artistici ed etnoantropologici delle Marche diventa museo dotato di autonomia, e dal 1 dicembre 2015 ne assume la direzione Peter Aufreiter
Oltre alla Galleria, il Palazzo Ducale ospita al piano terra il Museo Archeologico e Ladipario che ha avuto origine nelle raccolte di epigrafi radunate ad Urbino prima dal Fabretti esposte poi nel 1756 per volontà del Cardinale Stoppani alle pareti delle Soprallogge al primo piano, poi smontate e trasferite nel 1944 dal Soprintendente P.Rotondi a piano terra e successivamente nell’attuale sede.